LES PRELEVEMENTS D’AUTOPSIE NECESSAIRES A LA BONNE EXECUTION DES EXPERTISES TOXICOLOGIQUES


 


Dr. ADDOU  A.H

Service de Médecine Légale
C.H.U SIDI BEL ABBES

I-Introduction :

§Dans nombre d’affaires criminelles de ces  dernières années, des problèmes de prélèvements à visée toxicologique sont apparus. Soit, ils n’ont pas été réalisés, ou en quantité insuffisante, soit ils ont été mal prélevés, ou enfin mal conservés.
§Le problème de la nature et de la quantité des prélèvements n’est pas nouveau et certains médecins légistes l’avaient déjà posé. Citons LECOMTE et NICOLAS : «  la toxicologie est un domaine rempli d’embûches et une source de contestations, le toxicologue est d’abord tributaire du médecin légiste qui réalise les prélèvements, temps essentiel et irréversible ».

En 1990, DURIGON dresse la liste de prélèvements à effectuer : sang, urine, bile, contenu gastrique, viscères, cerveau, poumon, cheveux, ongles et os (Durigon M. : Protocoles médico-légaux thanatologiques. J. Méd. Lég. – Droit Médical 1990, 33, 3, 177- 198.).

D’une façon générale, et  afin d’accomplir   une  bonne expertise toxicologique: c’est-à-dire aboutir à des résultats fiables, répétables et donc totalement crédibles afin d’éviter les erreurs, il faut s’assurer du :

ØBon prélèvement des échantillons biologiques en vue de l’analyse (généralement en double : éventuelle contre expertise) ,
Øleur identification,
Øla nature des tubes et des récipients primaires et secondaires,
Øainsi que leur conservation. Ce dernier point est prépondérant en médecine légale du fait de la contre- expertise toujours possible.

II – Le prélèvement :

Identification / conservation (température – durée) / destruction

1. Identification du prélèvement : par :

– nom

– prénom

– date de naissance

– sexe

– date et heure du prélèvement

De plus, comme celui ci devra être conservé pendant des mois, voire des années parfois, au réfrigérateur ou au congélateur, l’encre et la colle devront être choisies pour résister à l’humidité des chambres froides.

2. Température de conservation :

A l’exception des cheveux qui doivent être conservés à température ambiante, et impérativement au sec, tous les autres prélèvements doivent être conservés au froid à 4°C ou congelés à -20°C, voire à -80°C si possible.

3. Durée de conservation :

Elle devrait durer au moins jusqu’au classement de l’affaire ou à son jugement.

4. Destruction et élimination :

La destruction des prélèvements ne devrait se faire qu’après accord écrit des autorités judiciaires.

Les échantillons prélevés lors de l’autopsie sont potentiellement au moins aussi contaminants,

voire plus, que les prélèvements biologiques effectués sur des patients vivants.

Il y a donc lieu, au minimum, de respecter les règles relatives à l’élimination des déchets à risque infectieux.

III – Les prélèvements d’autopsie :

Il faut  prélever d’emblée tous les milieux biologiques nécessaires pour la recherche des causes toxiques de la mort.

§Si l’ensemble des milieux biologiques ne sont pas prélevés d’emblée, lors de l’autopsie, le risque est grand de ne pouvoir apporter la preuve analytique.
§En effet, des prélèvements effectués a posteriori lors d’une exhumation, sont entachés d’une erreur due à la possible destruction des molécules organiques par les mécanismes bactériologiques, enzymatiques et chimiques de la décomposition.
§Ce type de prélèvement donne lieu, quoiqu’il arrive, à une difficulté majeure d’interprétation des concentrations mesurées dans les liquides putréfiés.

Et c’est ça le problème : « Que signifie l’identification d’une drogue dans un milieu biologique sans aspect quantitatif »…parce que :

 » c’est la dose qui fait le poison. « .

1. Liquides biologiques :

A. sang et liquide hématique :

En médecine légale, le sang se réduit le plus souvent à l’état de liquide hématique. C’est

incontestablement le milieu de base pour la recherche des causes toxiques de la mort malgré sa grande complexité : lipides, protéines, ions, métaux, débris cellulaires, etc.. qui rendent difficile l’extraction des xénobiotiques.

a. Sang cardiaque:

§Le sang cardiaque présente l’avantage de pouvoir être aisément prélevé, en quantité importante, et apporte la quantité de matière nécessaire à la réalisation d’une recherche toxicologique générale.
§Par contre, par suite d’une lyse des cellules myocardiques, on observe une augmentation très importante, des concentrations des toxiques à tropisme intra cellulaire et, bien sûr, de ceux dont la fixation tissulaire cardiaque est majoritaire( la digoxine, de la chloroquine, de l’imipramine, et certains antidépresseurs) :== d’où de possibles erreurs d’interprétation .

b. Sang périphérique :

§Il faut prélever quelques millilitres (5 ml) de sang périphérique (intra-iliaque, fémoral ou orbital sous clavier) additionné de fluorure de sodium (1 à 2 %) afin d’éviter l’apparition d’alcool endogène par fermentation anaérobie.
§Ce flacon sera réservé à l’alcoolémie et au dosage des molécules à tropisme cardiaque ou a grand volume de distribution. Il devra être totalement rempli afin d’éviter les pertes d’éthanol au moment de l’ouverture du flacon.

c. Sang périphérique pour recherches de composés volatils :

§ Ce type de composés, difficiles à identifier et à quantifier, mais assez couramment cause de

décès (solvants industriels, cyanures, poppers, anesthésiant, fréon) exige des conditions

rigoureuses de prélèvement.

§Seul un prélèvement par seringue étanche en verre ou plastique convient.  Et la technique utilisée pour identifier et quantifier ces composés c’est la chromatographie en phase gazeuse.

B. l’urine :

§C’est le liquide biologique de choix (par sa pureté (98 % d’eau) et sa simplicité), pour un dépistage rapide par immuno-analyse pour quelques familles de toxiques.
§Mais le problème c’est que : En l’absence de données sur la clairance rénale, les concentrations trouvées sont de peu d’importance.
§Par contre, l’identification des substances mères et/ou de leurs métabolites peut apporter des éléments précieux en fonction des caractéristiques pharmaco / toxicocinétique de la molécule sur le moment de la prise du toxique par rapport à l’heure du décès.
§De plus, l’existence d’un toxique dans l’urine peut  permettre une bonne évaluation quantitative du xénobiotique identifié dans le  sang.

C. contenu gastrique :

§ Ce milieu, présente l’avantage d’être souvent abondant. Il permet parfois de retrouver le produit recherché non métabolisé, voire même des comprimés plus ou moins délités. Dans ce cas, il est indispensable de les isoler rapidement, de les faire sécher et de les conserver dans un tube en verre bien fermé.
§En cas d’intoxication par des caustiques ménagers, il est évidemment le milieu de choix, voire le seul, pour le toxicologue. Parfois, la simple prise du pH est décisive (PH très élevé lors de l’ingestion de soude caustique), ou le dosage des chlorures (eau de javel) ou des fluorures (Rubigine : fluorure de sodium) ou d’heptane (Eau écarlate).
§ De plus, il est possible de réaliser avec succès, la détection rapide de certaines familles de toxiques, après centrifugation et dilution, par immuno-analyse . La confirmation par une méthode spécifique est bien entendu obligatoire.

D. le vitré :

§Prélevée au niveau de la chambre antérieure de l’œil, sans effraction vasculaire, ce prélèvement s’effectue à travers la cornée et le cristallin.
§Cette matrice est particulièrement intéressante dans les décès par traumatisme ou par innombrables plaies contondantes (coups de couteau) ou après incendie, cas pour lesquels le sang fait défaut.
§Ce milieu, bien protégé des contaminations bactériennes et fongiques, est intéressant pour différencier l’alcool endogène de l’alcool exogène.
§Si le dosage du potassium, qui diffuse de la rétine vers le vitré, est utilisé pour la datation de la mort, il est nécessaire que le corps ait été préalablement conservé au froid et que l’heure du prélèvement soit exactement connue. Il faut surtout, qu’immédiatement après le prélèvement

(Les deux yeux étant prélevés séparément), le vitré soit centrifugé pour éliminer les cellules

riches en potassium, ce qui fausserait toute interprétation. Ce paramètre ne peut faire partie que d’un faisceau d’arguments pour évaluer le délai post-mortem.

E. la bile :

§C’est un milieu biologique intéressant, bien que très difficile à utiliser, l’extraction des xénobiotiques étant complexe du fait de la présence des sels biliaires.
§Elle est prélevée à la seringue en quantité limitée ( 5 à 10 ml), conditionnée dans un flacon en verre,
§La bile est particulièrement intéressante en l’absence d’urine , parce que beaucoup de molécules et de métabolites ont un cycle entéro-hépatique  et se trouvent à des concentrations très supérieures aux concentrations sanguines et persistent plus longtemps que dans le sang.
§Ce milieu est particulièrement intéressant lorsqu’il s’agit d’une overdose à l’héroïne et qu’il n’y a pas d’urine, car l’on peut souvent y mettre en évidence la 6 monoacétylmorphine (6-MAM) qui signe la prise d’héroïne.

2. Les viscères :

Actuellement, les techniques d’analyses utilisées permettent de détecter le microgramme, le

nanogramme ou même le picogramme de substances actives et permettent de travailler à partir d’une quantité d’organes de l’ordre de quelques dizaines de grammes (20 grammes de chaque organe conditionné séparément ont été retenues comme quantité suffisante).

Les viscères à prélever actuellement :

Ces tissus sont utilisés :

§soit pour rechercher des toxiques qui s’y fixent particulièrement soit :
Ølorsque le corps est dilacéré par des traumatismes multiples (accident sur voie ferrée ou sur autoroute avec contribution de plusieurs véhicules),
Øou transpercés en de multiples endroits et exsangues (très nombreux coups de couteaux),
Øou carbonisés (les liquides biologiques classiques peuvent alors avoir totalement disparus),
§soit pour disposer de données pharmacocinétiques nécessaires à l’interprétation du mécanisme de l’intoxication.

A. Le poumon :

§Les toxiques volatils peuvent être introduits dans l’organisme par la voie respiratoire.
§Pour certains composés, comme le cyanomalonitrile ou autres molécules utilisées pour la fabrication des bombes, le toxique irritant ne se retrouve que dans les bronches ou le larynx. Il ne traverse pas les membranes alvéolaires et ne peut donc pas passer dans la circulation sanguine.
§D’une façon générale, pour tous les produits volatils, le poumon est l’organe de choix, à condition que l’autopsie ait lieu peu de temps après l’inhalation et que le prélèvement soit mis dans un contenant parfaitement étanche.

B. Le cœur :

Les cellules du myocarde fixent sélectivement entre autres molécules, les digitaliques, les antipaludéens et certains antidépresseurs.

C. Le cerveau :

Il présente un intérêt particulier pour les substances lipophiles à tropisme cérébelleux comme les opioïdes. De plus, dans la boite crânienne, relativement étanche, on peut retrouver des composés volatils ayant disparu des autres organes lors du phénomène de liquéfaction putréfactive.

D. Les reins :

Ils sont particulièrement indiqués dans la recherche des intoxications chroniques aux métaux lourds (plomb, mercure, arsenic, thallium, sélénium) et cadmium qui nécessitent de travailler sur des organes fraîchement prélevés.

E. Le foie :

Siège principal du métabolisme de nombreux xénobiotiques, est intéressant en l’absence de sang et de bile de par le cycle entéro-hépatique. Des métabolites disparus du courant sanguin peuvent se retrouver dans le foie (par exemple, la 6-monoacétyl morphine, élément indispensable pour distinguer une prise d’héroïne d’une prise thérapeutique de morphine).

3. Les cheveux, les poils, les phanères :

§Les phanères présentent l’avantage d’une conservation exceptionnelle, ce qui permet, à posteriori, de disposer d’informations toxicologiques pour diagnostiquer une éventuelle

intoxication ou exposition alors que toute autre matière biologique a disparu, à l’exception des os.

§De plus, les cheveux permettent de disposer d’une information toxicologique bien antérieure au décès.
§Le dosage de métaux (arsenic, thallium, plomb, mercure) dans les cheveux de cadavre est ancienne (1857). Cependant, il ya un délicat problème d’interprétation des éléments métalliques  car ils existent à l’état naturel dans les cheveux et dans la terre des cimetières.
§On ne peut pas trouver ce problème avec les molécules organiques xénobiotiques qui n’existent pas à l’état naturel (dans les cheveux ni dans la terre des cimetières).

L’analyse des xénobiotiques dans ce milieu est déjà ancienne. Dès 1979, les opiacés, puis la phencyclidine, les amphétamines, les barbituriques, etc.. étaient détectées et dosées dans les cheveux.

§En 1983, la chloroquine et ses métabolites étaient mis en évidence, en France, par Viala et collaborateurs.
§Le nombre de toxiques que l’on peut doser dans les cheveux ne fait que croître ; P. Kintz a édité récemment un ouvrage de synthèse sur ce sujet (Kintz P. : Drug testing in hair. CRC Press : New York, 1996).
§Plus récemment encore, une technique d’extraction en phase solide couplée à la chromatographie phase liquide haute performance / barrette de diodes et la chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse, vient d’être publiée. Elle permet d’identifier et de doser un très grand nombre de médicaments.

4. D’autres prélèvements :

§Les larves ;
§Certaines particules vestimentaires, et autres objets se situant à proximité du corps  (tels que mouchoir contenant des traces solvant, seringues…).

IV-Méthode d’analyse des toxiques isolés:

1. Réactions colorées :

Elles sont rarement caractéristiques mais peuvent encore avoir leur utilité, surtout sur les urines ou contenu gastrique.

2. Spectroscopie visible et ultraviolette :

Utilisée comme détection en chromatographie liquide.

3. Immunochimie :

§Pour l’analyse des fluides biologiques : on a :
ØLe dépistage immuno-enzymologique EMIT pour la mise en évidence de médicament et de drogues.
ØLa technique de radio-immunoessai RIA.
ØLa polarisation de fluorescence FPIA pour les médicaments et les stupéfiants.
§Les résultats obtenus par ces techniques doivent être confirmés par une méthode spécifique, du fait du risque d’interférences (faux positifs).

4. Chromatographie sur couche mince :

§L’extrait  biologique dans un solvant organique est déposé sur une plaque recouverte d’une phase stationnaire.
§La migration  des extraits est obtenue dans une cuve au moyen d’un mélange de solvants. Les molécules sont révélées  sous forme de taches colorées. Les résultats obtenus par cette méthode doivent être confirmés  par une technique spécifique.

5. Chromatographie en phase gazeuse :

§Cette technique d’analyse sépare les constituants d’un mélange. La séparation des constituants s’opère sur une colonne (remplie ou capillaire) renferment une phase stationnaire (liquide ou solide) qui est chauffée.
§Un flux de gaz vecteur (par exemple : azote, hélium) procède à la séparation des composés et les entraine vers un détecteur.
§Deux conditions sont à respecter en chromatographie en phase gazeuse ; les molécules analysées doivent être :
ØVolatilisables ;
ØEt thermiquement stables.

Chromatographie en phase gazeuse :

§Le couplage de la chromatographie en phase gazeuse et de la spectrométrie de masse est actuellement  la méthode de référence.

Principe : après séparation des molécules par chromatographie  en phase gazeuse, celles-ci sont ionisées dans un vide très poussé et sont ensuite soumises à des champs magnétiques et électrique très puissant. Les fragments dissociés obtenus sont ensuite sélectionnées en fonction du rapport de leur masse et  de leur charge électrique.

6. Chromatographie liquide haute performance :

§Dans ce type de chromatographe, un  mélange de solvants constitue la phase mobile.
§Cette phase mobile traverse une colonne constituée d’une phase stationnaire.
§Le mélange à analyser est  injecté au moyen d’une seringue dans un injecteur. Les constituant du mélange sont séparés sur la colonne et détectés (le détecteur transmet les informations à un enregistreurs.)

Chromatographie liquide haute performance

7. Electrophorèse capillaire :

§Il s’agit d’un tube capillaire ouvert ou rempli de 0,5 à 1 mètre  de long et de 50 à 100um de diamètre.
§Ce capillaire contient un électrolyte.
§Des tensions très élevées sont appliquées à travers cet electrolyte.il y a donc  migration des constituants d’un mélange par électrophorèse.

8. Spectroscopies d’absorption et d’émission atomique et torche à plasma :

Il s’agit d’instruments permettant l’analyse des éléments métalliques dans les milieux biologiques.

BIBLIOGRAPHIE:

*Livres:

– Pharmacologie et toxicologie médico-légale (édition d’ELSEVIER).

-Traité de médecine légale (Beauthier. édition de Boeck.2008).

*Liens web:

-www.Wikipédia.com

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