Les acides désoxyribonucléiques A.D.N.


1. Structure primaire

1.1. Caractéristique de composition

Ø  Ose = 2’désoxyribofuranose

Ø  Bases = majeures : Adénine, Guanine, Thymine et Cytosine        = désoxyribonucléotides

Mineures : dérivés méthylés de A et C

1.2. Polymérisation nucléotidique

Les nucléotides s’associent par des liaisons 3’-5’ phosphodiester pour former des chaînes polynucléotidiques

Représentations

Conséquences de la polymérisation :

  • La chaîne est vectorisée : le sens conventionnel est 5’         3’ adoptée pour l’écriture et la lecture des polynucléotides (de gauche à droite)
  • le squelette ose-phosphate porte des bases fixées selon une séquence spécifique de l’espèce moléculaire

1.1. Taille des ADN

Exprimée soit par :

  • La longueur
  • La masse moléculaire en Dalton
  • Le nombre de paire de bases (pb) (car une molécule d’ADN = association de couple de bases)

Rq : 1 pb = 660 Da ; 2.106 Da # 3000 pb # 1 µm

Cette taille est très variable de 5000 à plus de 100 millions de pb

Exemples : virus : phage l : 48 kb soit 32.106 Da soit 17 µm

bactérie : E.coli : 4000 kb soit 2600.106 Da soit 1,36 mm

2. Structure secondaire des ADN

Certaines observations suggèrent que la structure de l’ADN ne correspond pas simplement à une chaîne polynucléotidique mais à une structure plus complexe :

2.1. Les différentes observations

2.1.1. La règle de Chargaff

Du nom de la personne qui a remarqué (dans les années 1940) que :

  • Quelque soit l’espèce d’origine, l’ADN contient toujours autant de purine que de pyrimidine soit :

(A + G) = (C + T)   ou    (A+G) / (C+T) = 1

  • De plus, il y a autant de thymine que d’adénine      A/T = 1

autant de guanine que de cytosine    G/C = 1

Composition en bases de différents ADN

Par contre, le rapport (A+T)/(C+G) varie beaucoup : il est caractéristique de l’espèce. Ce coefficient est appelé coefficient de Chargaff

1.1.1. Etude de la diffraction des rayons X

Les résultats de ces expériences suggèrent une structure hélicoïdale de la molécule.

1.1.2. Autres expériences

Ex: Courbe de fusion : elles montrent que les chaînes polynucléotidiques sont maintenues par des liaisons H.

1.1. Modèle de Watson et Crick (Proposé en 1953.)

v  La molécule d’ADN est formée de 2 chaînes polydésoxyribonucléotidiques appelés brins enroulés pour former une double hélice qui s’enroule vers la droite (dextrogyre)

v  Les bases sont projetés vers le centre de l’hélice : les plans formés par les atomes de ces bases sont

o   parallèles les uns aux autres (plans face à face)

o   perpendiculaires à l’axe de la double hélice

o   distants entre eux de 0,34 nm

v  Les bases s’apparient par 2 (chacune appartenant à une chaîne) pour former des paires de bases. Elles sont liées l’une à l’autre par des liaisons H.

v  Les 2 chaînes sont antiparallèles : orientées en sens inverse

v  le pas de l’hélice = distance pour un tour de spire = 3,4 nm

Il y a donc 10 paires de base en moyenne par tour de spire.

v  Le diamètre de l’hélice et de 2 nm

v  Le squelette central est hydrophobe; l’extérieur est hydrophile

1.1. Liaisons hydrogènes du modèle

L’appariement des bases par 2 s’effectue toujours entre :

  • L’adénine et la thymine par 2 liaisons H
  • La cytosine et la guanine par 3 liaisons H

1.1.1. Caractéristiques géométriques de ces appariements

Théoriquement, ces 2 appariements ne sont pas les seuls possibles. Leur seule existence dans la molécule d’ADN s’explique par plusieurs caractéristiques géométriques :

Ø  La distance séparant les 2 liaisons N-glycosidiques est presque identique (1,08 nm et 1,11 nm)

Ø  L’angle formé par l’axe de liaison N-glycosidique et la ligne passant par les C1’ des riboses est constant (# 55°)

Ø  La position de la liaison N-glycosidique dans l’espace est invariable

Tout ceci fait que ces 2 paires de bases sont superposables.

1.1.1. Conséquences de ces appariements

ü  Il y aura forcément autant de bases A que T ainsi qu’autant de C que de G pour tous les ADN. Les bases sont dites « complémentaires »

ü  Comme à chaque A d’une chaîne correspond un T sur l’autre chaîne (idem pour C et G) , la séquence en bases d’une chaîne détermine automatiquement la séquence en bases de l’autre chaîne. Ces 2 chaînes sont donc complémentaires.

1.2. Les variants conformationnels de la double hélice

Il existe 3 conformations possibles pour la double hélice appelées : A, B et Z.

La conformation la plus stable dans les conditions physiologiques correspondant à la forme native des ADN est la conformation B.

caractéristiques B A Z
sens de l’enroulement droit droit gauche
pb par tour 10,4 11 12
pas 3,4 nm 2,8 nm 4,5 nm
diamètre 2 nm 2,3 nm 1,8 nm
sillons 

  • petit
  • grand

+

+

– 

+

conformation anti anti syn

2. Structure tertiaire des ADN

2.1. Les surenroulements

In vivo, les ADN ne reste pas à l’état linéaire mais se trouve, dans la plupart des génomes, sous forme fermée, soit :

  • Par liaison ester 3’-5’ de ses extrémités pour donner de l’ADN circulaire

(cas de certains virus, bactéries, mitochondries, chloroplastes)

  • Par les extrémités de sa molécule encrées sur des points fixes d’une matrice : ADN en boucles

(cas de l’ADN eucaryote accroché à la lamina sous la membrane interne de l’enveloppe nucléaire.

L’ADN présente alors une structure compactée par des surenroulements appelés torsades ou encore superhélices.

Il y a plusieurs possibilités :

Un ADN circulaire relâché englobe 10,5 paires de bases pour faire un tour d’hélice

  • Si l’ADN est surenroulé : il faut 9 pb pour un tour d’hélice ; On parle de torsades positives (pas gauche)
  • Si l’ADN est sousenroulé : il faut 11 pb pour un tour d’hélice ; on parle de torsades négatives (pas droit)

In vivo, seules les superhélices négatives sont rencontrées

Origine de ces superhélices négatives :

Ces torsades sont formées du fait de la présence de zones de dénaturation dans la molécule d’ADN.

Par exemple (cf. document ci-dessous), si l’ADN comporte 3 tours d’hélice en moins , la molécule compense instantanément en créant 3 torsades négatives :

In vivo, seules les superhélices négatives sont rencontrées

Origine de ces superhélices négatives :

Ces torsades sont formées du fait de la présence de zones de dénaturation dans la molécule d’ADN.

Par exemple (cf. document ci-dessous), si l’ADN comporte 3 tours d’hélice en moins , la molécule compense instantanément en créant 3 torsades négatives :

Passage d’une forme circulaire relâchée à une forme torsadée.

Les nombres correspondent aux tours de double hélice

1.1. Quantification de cette structure torsadée

On définit :

  • L = indice de torsion : nombre de tours fait par un brin autour de l’autre brin dans une molécule fermée d’ADN. Ce nombre est positif (pour une db hélice de pas droit) et constant
  • T = torsadage : nombre total de tours
  • W = vrillage : nombre de supertours affectés de son signe

L= T+W

1.2. Enzymes responsables de ces structures

Des enzymes catalysent l’apparition et la disparition de ces torsades. Ce sont les toposoimérases présentes chez toutes les bactéries et cellules eucaryotes.

2. Propriétés des ADN

2.1. Solubilité

  • L’ADN est un polyanion dont les sels de sodium sont solubles dans l’eau en formant des solutions à viscosité élevée.
  • Les sels de sodium d’ADN sont précipitables par l’éthanol, l’isopropanol (modification de la constante diélectrique du milieu, diminution de l’hydratation des molécules et précipitation);

2.2. Absorption U.V.

Les ADN absorbent à 260 nm du fait de la présence des bases.

Effet hypochrome :

L’absorption de la molécule d’ADN est nettement inférieure à celle que l’on obtiendrait avec un mélange des mêmes bases libres aux mêmes concentrations car le e des bases libres est bien supérieur au e des bases appariées (si e diminue pour une même concentration (c), A diminue aussi)

Donc cette différence d’absorption (environ 30%) entre ADN et mêmes bases libres est due à l’appariement des bases par liaison H

Ce phénomène est appelé effet hypochrome.

2.3. Dénaturation chimique

Les agents dissociants (urée, amides) dénaturent la double hélice .

La streptomycine précipite l’ADN.

2.4. Hydrolyse de l’ADN:

ADN stable en milieu alcalin ( ≠ ARN)

ADN hydrolysé en milieu acide et à chaud : H3PO4 + bases + pentose détruit

Hydrolyses enzymatiques : cf.  » Les méthodes d’études des acides nucléiques »

2.5. Dénaturation thermique

2.5.1. La dénaturation

Si l’on chauffe progressivement une solution aqueuse diluée d’ADN natif, on constate :

  • Une diminution de la viscosité
  • Une augmentation de l’absorbance à 260 nm au fur et à mesure de l’augmentation de température appelé effet hyperchrome dans une zone restreinte de température (entre 75 à 100 °C), selon :

Cette courbe est appelée : courbe de fusion

Explications :

L’augmentation de l’absorbance lorsque la température augmente montre que les bases azotées se retrouvent sous formes libres (augmentation de e donc de A). Il y a donc rupture des liaisons H sous l’effet de la chaleur (d’autant plus que la température est élevée), ce qui entraîne une dissociation des brins, l’ADN se retrouve à l’état monocaténaire , il est donc dénaturé.

On parle de fusion .

Détermination du point de fusion Tm

On définit le point de fusion noté Tm = température pour laquelle l’absorbance à augmenter de moitié , l’ADN est donc demi dénaturé.

Tm = t(°C) pour DA/2

La valeur du Tm est variable, il dépend de la composition en bases de l’ADN. Plus la teneur en (G+C) d’un ADN est importante, plus la valeur du Tm est grande car les 2 brins sont d’autant plus difficiles à séparer car maintenues par plus de liaisons H. (3 liaisons pour GC contre seulement 2 pur AT)

Exemple : mammifères 40% de G+C : Tm = 87°C

E.coli , 50% de G+C : Tm = 92°C

Pour les petits fragments (amorces en PCR), on applique la règle de Wallace:

Tm = 4*(nombre de bases GC) + 2*(nombres de bases AT)

ex:  dagtcatgccccgcgc        Tm =   4*11 +2*4 = 52°C

2.5.2. La renaturation

Le retour à l’ADN natif double brin est possible dans certains cas.

Si l’on part de l’ADN dénaturé, 2 évolutions possibles :

Refroidissement progressif

On observe un retour à l’absorbance initiale et la masse moléculaire de l’ADN natif.

On obtient donc de l’ADN renaturé : les bases complémentaires se sont réassociées ; la structure de la double hélice et les propriétés biologiques sont rétablies.

Remarque : La renaturation totale n’est possible que si l’ADN de départ n’est formé que d’un seul type moléculaire. Si plusieurs types d’ADN sont présents au départ, on obtient un mélange de chaînes et la renaturation devient aléatoire.

Applications :

Obtention d’acides nucléiques  hybrides :

Ø  ADN hybrides : entre des brins d’ADN d’espèces voisines (si les séquences sont suffisamment analogues pour permettre une complémentarité partielle).

Ø  ADN-ARN hybrides : pour étudier leur complémentarité de structure.

Refroidissement brutal

Le temps est insuffisant pour la recherche des complémentarités, les molécules sont dites « gelées » ou « trempées » par formation d’appariement intra- et intermoléculaire, et agrégation.

Dénaturation et renaturation de l’ADN

3. Répartition et état des ADN

A l’exception des virus à ARN, l’ADN est un constituant universellement présent dans la matière vivante.

3.1. L’ADN bactérien

Il correspond à l’ADN des Procaryotes.

v  Non contenu dans un noyau pourvu d’une enveloppe nucléaire.

v  ADN = 1 seule molécule

v  Circulaire

v  Bicaténaire

v  Structure très condensée

Exemple : E.coli :  ADN = 4.106 pb ; 3.109 Da ; 1,36 mm dans une bactérie d’environ 5 µm de long

Structure en superhélices avec des torsades négatives.

3.2. L’ADN des plasmides

Plasmides = éléments génétiques extrachromosomiques présents chez de nombreuses bactéries, porteurs de gènes et capables d’autoreproduction.

ADN = bicaténaire, circulaire et de taille variable

3.3. L’ADN viral

Les virus ne comportent pas tous de l’ADN (certains virus portent de l’ARN)

v  La structure la plus courante de l’ADN des virus à ADN : bicaténaire et circulaire

Mais il  existe aussi des virus à

v  ADN monocaténaire circulaire (phage X174 d’E.coli)

v  ADN linéaire (phage T7)

v  ADN circulaire ou linéaire selon le stade de son développement (phage l) car possède des extrémités monocaténaires complémentaires permettant la cyclisation.

3.4. L’ADN des cellules eucaryotes

L’ADN eucaryote est

v  sous forme de plusieurs molécules (correspondant aux chromosomes à l’état condensé)) inclues dans la chromatine (à l’état décondensé)

v  double brin, bicaténaire.

v  Séquences répétées nombreuses (40 à 70%) , non codantes

v  Arrimé à la lamina par les télomères (lamina = couche fibreuse protéique localisée sous la membrane interne de l’enveloppe nucléaire)

v  Associé à des protéines : les histones pour former un complexe nucléoprotéique.

3.4.1. Les histones

5 types d’histones interviennent dans le chromatine : H2A, H2B, H3, H4, et H1

Ce sont des protéines très basiques du fait d’un grand nombre de résidus Arg et Lys dans leur structure. Elles sont riches en charge positive et pourront établir des liaisons avec les phosphates.

3.4.2. Les nucléosomes

Ce sont les « sous-unités »de la chromatine. Ils sont formés par l’association histones / ADN selon :

Les histones H2A, H2B, H3, H4 s’associent par paire puis entre eux pour former un octamère d’histones autour duquel l’ADN s’enroule par 1,8 tours (soit 146 pb) en superhélice. (core)

Entre 2 nucléosomes, il y a environ 50 pb correspondant à l’ADN de liaison : partie la plus sensible aux nucléases (= enzymes de digestion de l’ADN)

Cette association forme « la fibre en collier de perle de 10 nm » ; qui correspond à une réduction de longueur de l’ADN d’un facteur 6.

3.4.3. La fibre de 30 nm

Elle correspond à un compactage de la fibre de collier de perle assuré par les molécules d’histones H1 fixées sur l’ADN de liaison et qui s’associe à chaque nucléosome. Ce compactage entraîne la formation d’un arrangement hélicoïdal (= solénoïde) qui diminue la longueur de la molécule d’ADN d’un facteur 50. (la chromatine)

Remarque : pour que la longueur de la chromatine entre dans la longueur des chomosomes, il faut un facteur 7000 ; ce niveau supérieur d’organisation est encore mal connu.

3.5. L’ADN mitochondrial

Les mitochondries des cellules eucaryotes contiennent

v  4 à 6 molécules d’ADN

v  bicaténaire et circulaire

v  de composition nucléotidique différente de celle du noyau

v  avec taux de GC faible.

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